Hipótesis:

Nuestra hipótesis propone que el tratamiento personalizado in vitro de los fibroblastos y células neuronales derivados de los pacientes con AP con una amplia gama de opciones farmacológicas disponibles actualmente, y el seguimiento de su efecto sobre los cambios fisiopatológicos ayudará a una mejor y más objetiva elección terapéutica para los pacientes. 

Objetivos específicos:

1- Caracterización de la fisiopatología de los fibroblastos derivados de los pacientes con AP.

2- Cribado de fármacos en los fibroblastos derivados de los pacientes AP. Evaluación de los fármacos capaces de mejorar las alteraciones fisiopatológicas. Así mismo, estudiaremos los mecanismos moleculares subyacentes en la actuación de los fármacos con efectos positivos.

3- Generación de células neuronales por reprogramación directa de los fibroblastos de los pacientes AP.

4- Los compuestos positivos en el cribado con los fibroblastos serán evaluados en las células neuronales diferenciadas.

 

Metodología

1- Caracterización de la fisiopatología de los fibroblastos derivados de los pacientes con AP. La selección de las alteraciones que permitan la evaluación de la efectividad de los tratamientos en el cribado farmacológico.

1.1 Selección de las alteraciones fisiopatológicas apropiadas para la evaluación de la efectividad de los tratamientos en el cribado farmacológico: Metabolómica para detectar los ácidos acumulados.

Niveles de expresión de la proteína mutada. Alteraciones en la síntesis de proteínas mitocondriales. Alteraciones de los complejos de la cadena respiratoria. Alteraciones bioenergéticas y estrés oxidativo. Alteraciones de la proteostasis/autofagia/mitofagia. Alteraciones del inflamasoma. Susceptibilidad a la muerte celular en medio respiratorio. Susceptibilidad a la senescencia.

Los protocolos de los estudios están descritos en las publicaciones del grupo: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=sanchez+alcazar

1- Cribado de fármacos en los fibroblastos derivados de los pacientes con AP. Evaluación de los fármacos capaces de mejorar las alteraciones fisiopatológicas. Así mismo, estudiaremos los mecanismos moleculares subyacentes en la actuación de los fármacos con efectos positivos.

Tarea 2.1- Cribado de alto rendimiento. Los fibroblastos serán sembrados en placas de 24 pocillos. La distribución de reactivos de ensayo y medios de cultivo será realizada por una estación automática de manejo de líquidos (Biomek FX, Block).

Posteriormente, ensayaremos una librería farmacología utilizados con frecuencia en el tratamiento de los pacientes mitocondriales a 5 concentraciones, teniendo en cuenta la ED50 (la dosis o concentración que causa el 50% del máximo efecto biológico de interés) de cada compuesto (1/10 ED50, 1/2 ED50, 1xED50, 2x ED50 y 10x ED50) o la concentración establecida utilizada en la literatura. Consideraremos compuestos positivos aquellos que sin ser tóxicos sean capaces de revertir más de un 75% las alteraciones fisiopatológicas en los fibroblastos derivados de los pacientes con AP. 

 

Los tratamientos se realizarán con los fármacos clasificados por sus mecanismos de acción terapéutica, y expuestos a continuación:

a- Tratamientos para paliar el déficit energético: Biotina, Riboflavina, Ubiquinona, Vitamina K3, AScorbato, Succinato, Menadiol, Tiamina, Creatina, Uridina, Dicloroacetato, Succinato, Piruvato.

b- Tratamientos para paliar el estrés oxidativo: EPI-743, Tocoferol, Ascorbato, Retinol, Menadiona, Ubiquinona, MitoQ, glutation, Ácido Lipoico, Omega 3, Omega 5.

c- Activadores mitocondriales: Carnitina.

d- Tratamientos para eliminar los metabolitos tóxicos: Tiamina, Carnitina, Dicloroacetato, Bicarbonato.

e- Tratamientos que modulen la autofagia/mitofagia: Rapamicina, Ciclosporina y una colección de 90 reguladores autofagia.

f- Otros tratamientos: Cuerpos cetónicos.

g- Reguladores Inflamasoma: Ac-YVAD-cmk (Caspase-1 inhibitor); Bay11-7082 (NLRP3 Inflammasome Inhibitor); Glibenclamida (NLRP3 Inflammasome Inhibitor).

h- Activadores de la biogénesis mitocondrial: AICAR, resveratrol, bezafibrato, nicotinamida…etc.

i- Combinaciones de distintos tratamientos. Los fibroblastos serán expuestos a los diferentes fármacos al menos dos semanas.

Tarea 2.2. Confirmación de la eficacia de los principios activos positivos seleccionados en el rescate de los defectos fisiopatológicos en los fibroblastos mutantes. Para confirmar el rescate de los compuestos positivos, se llevarán a cabo diferentes ensayos en los fibroblastos. Así, tras el tratamiento con los compuestos favorables seleccionados estudiaremos en profundidad la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, la mitofagia y la biogénesis mitocondrial, así como las tasas de apoptosis espontánea e inducida.

 

2- Generación de células neuronales por reprogramación directa de los fibroblastos de los pacientes con AP.

Para la reprogramación directa, seguiremos protocolos descritos previamente en la literatura (3-6). Utilizaremos vectores lentivirales que contienen factores de transcripción específicos del linaje neural. Los fibroblastos derivados de los pacientes se incubarán en placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1%. El día siguiente, las células se infectarán con un conjunto de vectores lentivirales que contienen factores de transcripción específicos del linaje neural, tales como Acsl1 y Brn2. Tres días después de la transducción viral, el medio de los fibroblastos será reemplazado por un medio de diferenciación neuronal complementado con factores de crecimiento específicos neuronales. La mitad del medio de conversión neuronal se reemplazará cada 2-3 días. Veinticinco días después de la infección, las células neuronales se identificarán mediante la expresión de TAU y la proteína citoesquelética específica de neuronas MAP2. Las células DAPI+, MAP2+ y TAU+ se considerarán neuronas inducidas. El ensayo de caracterización neuronal se realizará mediante inmunocitoquímica y RT-PCR cuantitativa. La disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, la mitofagia, la biogénesis mitocondrial, las alteraciones bioenergéticas y la apoptosis inducida o espontánea serán examinadas en las neuronas inducidas control y mutantes.

3- Los compuestos positivos en el cribado fibroblastos serán evaluados en la restauración de las alteraciones patológicas en las células neuronales mutantes. Después de obtener los cultivos neuronales estas serán sometidas a diferentes ensayos para observar cualquier alteración en la proliferación y la fisiopatologías de las células portadoras de las mutaciones particulares.

Análisis estadístico: La calidad y robustez del cribado de alto rendimiento se determinará calculando el factor Z como describen Zhang et al. (7). Consideraremos la calidad del ensayo como aceptable cuando el valor del factor Z se encuentre entre 0,5 y 1. El análisis estadístico incluirá el test “t” de Student y el análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico SSPS (Statistical Package for the Social Sciences). 

 

Equipo de investigación:

El equipo de trabajo está formado por dos doctores Mónica Álvarez Córdoba (MAC) y Juan Miguel Suárez Rivero (JMSR); y 3 estudiantes de doctorado: Marta Talaverón Rey (MTR), Licenciada en Biología; Suleva Povea Cabello (SPC), Graduada en Nutrición; Irene Villalón García (IVG), Graduada en Nutrición, Manuel Munuera Cabeza, Graduado en Biotecnología (MMC) y Alejandra Suárez Carrillo (ASC) graduada en Ciencias Ambientales, Grupo de investigación y las instalaciones a disposición para la parte experimental del proyecto. 

Durante los últimos 15 años, el Dr. Sánchez Alcázar, PI del proyecto, ha estado trabajando en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=sanchez+alcazar ; https://www.researchgate.net/profile/Jose_Sanchez-Alcazar).

Las instalaciones disponibles en el laboratorio del Dr. José Antonio Sánchez Alcázar, situado en el CABD son: Centrífugas, espectrofotómetro, material y equipo necesario para llevar a cabo RT-PCR; Material y equipo necesario para llevar a cabo Western blotting, campanas de flujo laminar, equipo de HPLC, incubadores para células en cultivo, servicio de citometría de flujo y microscopía, instalaciones para trabajar con material radiactivo, equipo Seahorse, sistema de imagen automático IN Cell 2000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y estaciones automáticas para el manejo de líquidos. El CABD dispone de equipos de última generación para poder realizar los objetivos del proyecto.